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Enzymatische Verfahren / Enzymatik

Enzyme

Enzyme sind Eiweißmoleküle (Proteine), die von allen lebenden Zellen und Mikroorganismen gebildet werden. Als Biokatalysatoren sind sie in der Lage, biochemische Prozesse extrem zu beschleunigen, ohne dabei selbst verändert oder verbraucht zu werden. Reaktionen, die mit Enzymen in Millisekunden ablaufen, würden sonst Jahre benötigen.

Wirkungsweise von Enzymen

Die Ausgangsstoffe einer Enzymreaktion (Substrate) werden im aktiven Zentrum des Enzyms gebunden und es entsteht ein Enzym-Substrat-Komplex. Das Enzym verändert die räumliche Struktur des Substrats, wodurch Bindungen gelockert werden. Der Komplex zerfällt und Reaktionsprodukte und das Enzymmolekül werden freigesetzt. Das unveränderte Enzymmolekül kann nun weiter Substratmoleküle umsetzen.

Eine Zeichnung mit Enzym-Reaktion

Ein Enzym erkennt immer nur ein Substrat und katalysiert genau eine Reaktion. Dies wird als Substrat- und Reaktionsspezifität bezeichnet.

 

 

Enzymatische Analyse

Der Begriff der „enzymatischen Analyse“ ist eine Sammelbezeichnung für Methoden, in denen Enzyme zur Bestimmung eingesetzt werden und umfasst zwei prinzipiell unterschiedliche analytische Verfahrensweisen:

1. Die Messung der Enzym-Aktivität mithilfe des entsprechenden Substrats2. Die Messung der Substratkonzentration mithilfe des entsprechenden Enzyms
Da Enzyme nur in geringer Konzentration vorliegen, ist es schwierig, die Enzymmenge direkt zu bestimmen. Daher wählt man eine indirekte Bestimmungsmethode und ermittelt die Enzymaktivität, d.h., man bestimmt den Substratumsatz pro Zeiteinheit (=Aktivität) unter standardisierten Bedingungen. Die Messung erfolgt fotometrisch. Der Probe wird ein Enzym zugesetzt, das die gesuchte Substanz umsetzt. Dabei entstehen Produkte, die fotometrisch gemessen werden können. Ist die direkte Messung nicht möglich, wird häufig mit gekoppelten enzymatischen Reaktionen gearbeitet.
Beispiel:
Bestimmung der Amylase-Aktivität in Honig

Enzyme sind Proteine und deshalb hitzeempfindlich. Geringe Amylaseaktivitäten im Honig können ein Indikator dafür sein, dass der Honig bei der Herstellung zu hoch erhitzt wurde und deshalb als minderwertig einzustufen ist.
Beispiele:
Die mengenmäßige (quantitative) Bestimmung von Stärke, Glucose, Fructose, Lactose,  Mannose,  Saccharose, Ameisensäure, Apfelsäure, Citronensäure, Ascorbinsäure, Asparaginsäure, Glutaminsäure und weiteren zahlreichen Substanzen

Die enzymatischen Reaktionen verlaufen in der Regel nach folgendem Muster:

Beispiel

Die quantitative Glucosebestimmung mithilfe von Enzymen. Dieses Prinzip findet auch u. a. bei der Blutzuckerbestimmung in der Medizin Anwendung.

ATP Adenosin-5’-triphosphat
HK Enzym Hexokinase
G-6-P Glucose-6-Phosphat
ADP Adenosin-5’-diphosphat
NADP+ Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphat
G6P-DH Enzym Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase
NADPH reduziertes Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphat

Glucose wird mithilfe des Enzyms Hexokinase umgesetzt, aber weder die Glucose noch das Produkt, das Glucose-6-Phosphat noch die beteiligten Kofaktoren ATP und ADP sind fotometrisch messbar. Das Beispiel zeigt, das manchmal mehrere enzymatische Reaktionen nötig sind, bis ein messbares Reaktionsprodukt entsteht.

Das Produkt der ersten Reaktion (Glucose-6-Phosphat) wird also zum Substrat für die zweite Reaktion. Vermittelt durch das Enzym G-6-P-Dehydrogenase entstehen aus dem Glucose-6-Phosphat und NADP+ das D-Gluconat-6-Phosphat und NADPH und H+.

Die entstandene NADPH-Konzentration ist proportional der Glucose-Konzentration und kann fotometrisch gemessen werden.

Bei enzymatischen Reaktionen können gefärbte Endprodukte entstehen, die im sichtbaren Bereich des Lichtspektrums messbar sind. Sehr häufig entstehen jedoch Produkte (wie in dem oben gezeigten Beispiel), die nur im ultravioletten Bereich messbar sind. Diese Tests werden auch enzymatische UV-Tests genannt.

Enzymatische UV-Tests

Im UV-Test dienen Extinktionsänderungen von Coenzymlösungen als Messgröße. Dabei macht man sich die Eigenschaft der Coenzyme NAD+ und NADP+ zu Nutze, dass sie sich in oxidierter Form im Hinblick auf die Lichtabsorption von der reduzierten Form unterscheiden. Bei der enzymatischen Umwandlung entsteht bzw. verschwindet je nach Richtung der Reaktion der Absorptionspeak bei 340 nm.